Тел по Москве +7(495)-552-31-94, Тел по России 7-9999-94-95-00
Перейти к контенту

Главное меню:

Как уничтожают микробов

КАК УНИЧТОЖАЮТ МИКРОБОВ
МИКРООРГАНИЗМЫ — СТРОИТЕЛИ
МИКРОБЫ — ЖИВЫЕ ИНДИКАТОРЫ
АКТИВНЫЙ ИЛ
ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТА УРЕАЗЫ


КАК УНИЧТОЖАЮТ МИКРОБОВ


Ученые разработали различные методы, с помощью которых можно уничтожить или затормозить развитие микроорганизмов. На этом основаны современные методы стерилизации и пастеризации, широко применяемые на практике не только в пищевой промышленности, но и в других производствах.


Физические методы.

Влияние света. Наиболее сильным действием на микробы обладают прямые лучи солнца. Ультрафиолетовые лучи (длина волны 10—330 ммк) обладают выраженным антимикробным действием. В этом заключается гигиеническое значение солнечного света. На этом основано применение ультрафиолето¬вых лучей в медицине для лечения различных инфекционных заболеваний кожи. С помощью ультрафиолетовых лучей производят обеззараживание воздуха в боксах, хирургических операционных, производственных помещениях, где получают стерильные биологические препараты, и т. д.
Ионизирующие излучения. Губительно также действуют на микробов рентгеновские лучи и поток элементарных частиц — нейтронов.
Температура. Высокие температуры убивают микробы, низкие же и даже сверхнизкие (Температура жидкого азота —196° С, жидкого кислорода, жидкого водорода и др. от —180 до —252° С.) Этим свойством не обладают, но тормозят развитие микроорганизмов.
Когда мы говорим о действии высоких температур, допус¬тим + 100° С, то даже такая высокая температура убивает не все микробы. Вегетативные формы микробов действительно гибнут, но споровые выдерживают кипячение. Даже среди вегетативных форм одни гибнут при 70—80° С (кипячение убивает их мгновенно), а другие — лишь через 15—30 минут. Сле-довательно, среди микробов могут быть более чувствительные или менее чувствительные к действию высоких температур, различие лишь в степени чувствительности. Высокие темпе-ратуры (выше 100° С) губительно действуют на все микробы.
Низкие температуры, не убивая микробов, вместе с тем тормозят их жизнедеятельность, в том числе бродильные и гнилостные процессы. Многие пищевые продукты поэтому при низких температурах, не подвергаясь микробному воздействию, длительное время сохраняются свежими и не портятся. На этом основано хранение мяса, рыбы, молочных продуктов в холодильниках и даже длительная перевозка скоропортящихся пищевых продуктов в вагонах и судах-рефрижераторах.
Простейшим способом стерилизации является кипячение при 100° С. Однако однократное нагревание, убивая вегетативные формы, сохраняет живыми споры. Для полного уничтожения микробов прибегают к дробной стерилизации или троекратному кипячению с интервалом в сутки. Споры, сохранившиеся после первой стерилизации, прорастут, а образовавшиеся вегетативные формы погибают при повторном кипячении. Для большей надежности стерилизацию производят в третий раз.
Методом надежной стерилизации является автоклавирование. Для этого используются автоклавы. Это приборы различной величины и конструкции для влажной стерилизации ( При температуре выше 100° С стерилизуют и в печах Пастера, но нагретым воздухом (сухожаровая стерилизация). В Них стерилизуют при температуре выше 100° С (120° С и выше). Благодаря герметично закрываемой крышке в автоклаве повышается давление и конденсируется пар. Таким образом, высокая температура и насыщенный пар под давлением быстро, в течение 20—30 минут убивают все микробы, в том числе и самые стойкие споры.
Все ли можно автоклавировать и все ли нужно автоклавировать? Конечно, нет. Многие пищевые продукты, такие, как углеводы, молоко, витамины и др., не переносят высоких тем-ператур. Их пастеризуют. Пастеризация — это метод частич¬ной стерилизации при температуре 70—80° С в течение 10 минут или при 60° С в течение 30 минут. Используя этот метод, нельзя убить споры, но многие вегетативные формы микробов погибают и дают возможность на некоторый срок сохранить (особенно на холоде) молоко, его вкус и питательную ценность.
Высушивание. Известно, как долго сохраняются и не подвергаются микробному воздействию и порче вяленая рыба, сушеное мясо, сухие овощи, фрукты и т. д. Высушивание тормозит жизнедеятельность, а при отсутствии влаги губительно действует на вегетативные формы микробов. Благодаря этому прекрасно сохраняются сухие лекарственные травы.
Интересно, что особым методом Сушки можно сохранять живыми в высушенном состоянии даже  микробы. Это очень большое достижение науки, давшее возможность сохранять чистые культуры микроорганизмов для лабораторной и медицинской практики, а также различных отраслей народного хозяйства, например для производства бактериальных удобрительных препаратов. Хорошо сохраняются высушенные молочнокислые бактерии, которые применяют для закваски молока,
а также некоторые живые вакцины для профилактики инфекционных болезней.
Высокое давление. Микроорганизмы выдерживают чрезвычайно высокие давления, полностью сохраняя свою жизнеспособность. В эксперименте использовалось давление до 3000 атмосфер, и микробы остались живыми. Дрожжи не теряли своей биохимической активности и бродильных свойств после воздействия давлением до 500 атмосфер.
На глубине 9—10 километров в океане обнаружены микро¬организмы. Живущие при колоссальном давлении толщи воды, по мнению некоторых ученых, они способствуют образованию ценных минералов, железа, марганца. Разрабатываются методы промышленной добычи их со дна морей и океанов.
Лауреат Ленинской премии профессор А. Е. Крисс пишет: «Учитывая массовое распространение этих микроорганизмов в Мировом океане, трудно отрешиться от мысли, что железомарганцевые конкреции в виде довольно крупных лепешек, буквально усеивающие дно океанов, являются результатом их биохимической деятельности. В настоящее время выдвинут даже проект промышленной добычи со дна океанов этих железомарганцевых конкреций, содержащих и ряд других ценных элементов»
А. Е. Крисс. Микробы в океанских глубинах. М., «Знание», 1960.

Химические методы

Химические вещества и газы широко применяются для уничтожения микробов. Так, к числу антисептиков (Антисептики — это химические вещества, вызывающие гибель микробов) и дезинфицирующих веществ относятся кислоты, щелочи, спирты, металлоиды, соли тяжелых металлов, различные органические соединения.
Действие химических веществ на микроорганизмы зависит в основном от силы реакции между этими ядовитыми веще¬ствами и цитоплазмой микробной клетки. Оно зависит также от концентрации растворов химических веществ и степени химической диссоциации (Диссоциация — распад сложного химического вещества на его составные части) их. Степень же диссоциации часто- прямо пропорциональна губительному действию на микробы. К примеру, раствор сулемы в воде обладает сильно обеззараживающим действием, аналогичный же раствор в глицерине слабым действием. Нарушение ферментативной деятельности микробов также приводит их к гибели.


МИКРООРГАНИЗМЫ — СТРОИТЕЛИ


Анаэробные микробы оказались полезными также в строительстве прудов. Разведение рыб является одной из важных отраслей хозяйства, приносящей большие доходы, а населению ценные продукты питания. Многие хозяйства создают искусственные водоемы, но иногда вода просачивается и уходит. Кроме того, вокруг водоемов, где происходит фильтрация воды, местность заболачивается. Специалистам пришла удач¬ная мысль использовать анаэробные микроорганизмы для изменения структуры почвы, уплотнения дна и создания водонепроницаемого слоя.
Делается это так. На дно будущего водоема для создания прочного ложа укладываются отходы сельскохозяйственного производства, богатые клетчаткой (солома, стебли кукурузы и т. д.), а затем прикрываются слоем земли. Все это увлажняется и обильно заселяется анаэробными микробами, которые в процессе своей жизнедеятельности в такой степени изменяют структуру почвы, что фильтрация воды становится невозможной. Этот метод, разработанный учеными Грузинского научно-исследовательского института гидротехники и мелиорации, окажет большую помощь в развитии рыбного хозяйства.


МИКРОБЫ — ЖИВЫЕ ИНДИКАТОРЫ

Более полувека назад известный советский микробиолог академик В. Л. Омелянский полагал, что настало время ввести бактериологический метод в химию, предоставив ему равноправное место наряду с другими методами. Как блестяще оправдались слова ученого. Теперь доказано, что многие микроорганизмы нередко более чувствительные индикаторы, нежели иные химические. Достаточно перечислить лишь отдельные области использования микробов в качестве биологических индикаторов, чтобы оценить их огромное научное и практическое значение.
Например, микробы как живые индикаторы применяются:
1) на промышленных предприятиях, где производятся та¬кие жизненно важные препараты, как витамины, антибиотики, аминокислоты;
2) на заводах, вырабатывающих корма для животных;
3) в почвоведении;
4) в геологии для разведки нефти и газа;
5) в океанологии при изучении перемещения вод в Миро¬вом океане и для определения загрязнения морской воды сточными водами;
6) для обнаружения ничтожно малых количеств кислорода, азота, аммиака;
7) для изучения космической радиации во время полетов
космических кораблей.
Итак, в почве, воде и космосе микробы как высокочувствительные биологические индикаторы служат человеку в различных сферах его деятельности.
Остановимся на некоторых примерах. Покажем интерес и значение нового микробиологического метода и перспективы применения биологических индикаторов.
Для обнаружения витаминов применяют различные методы: биологический, химический, микробиологический и др. Биологический метод основан на том, что при недостатке или отсутствии в пище того или иного витамина животные отвечают патологическим состоянием — авитаминозом, т. е. нарушением нормальной (физиологической) жизнедеятельности организма. Если лишить пищу животного определенного витамина, можно вызвать авитаминоз с типичными проявлениями этого заболевания. На этом принципе основан метод определения того или иного витамина и его количества в испытуемых субстратах, пищевых продуктах и т. д. Метод этот специфичен, убедителен, но требует для опытов экспериментальных животных, поэтому он связан со значительными затратами и, кроме того, длителен. Авитаминоз проявляется не сразу, а по истечении длительного времени от начала опытов.
• В противоположность биологическому методу химический экономически более выгоден, но уступает ему в точности. Более эффективным, быстрым, недорогим, а самое главное высок                                                                                                                                                                                                                   оспецифичным (точным) является микробиологический метод, основанный на использовании в качестве биологических индикаторов различных микробов.
Найдены и на практике используются культуры микробов, которые настолько чувствительны к тому или иному витами¬ну, они настолько нуждаются в нем, что на питательной среде и отсутствии определенного витамина не растут. Наоборот, прибавление витамина к среде стимулирует рост и бурное размножение индикаторных микробов. Благодаря этому можно быстро и достаточно точно определять содержание витамина в испытуемом веществе, проверяя каждый опыт (определение) контрольными наблюдениями. Для каждого витамина в лабораторных условиях сохраняются чистые культуры индикаторных микробов, непрерывно проверяются их свойства и контролируется их ценность для производственного процесса.


Блинкин Семен Александрович
Б69 Удивительные профессии микробов (микро¬биология народному хозяйству). М., «Знание»,
1974.


Предисловие

Интерес к проблемам охраны водных ресурсов от истощения и загрязнения и прогнозирования качества воды особенно возрос з последнее десятилетие в связи с резким увеличением потребления воды промышленностью, сельским и коммунальным хозяйством. Большая часть отработанной воды после предварительной очистки отводится или, просочившись через почву, возвращается в реки, озера, водохранилища. Однако вода загрязняется при растворении и вымывании минеральных и органических удобрений, средств химической защиты растений от болезней и вредителей. Загрязненные стоки, попадая в реки и водоемы, трансформируются в пространстве и во времени. При этом происходят физико-химические и биологические процессы, в результате которых изменяются концентрации загрязняющих веществ и биохимическое потребление кислорода, что приводит к гибели рыбы и многим другим нежелательным последствиям.
Водность и гидродинамика потока, характер и интенсивность химических реакций и биологических процессов определяют предельно допустимую нагрузку на водный объект, необходимую степень очистки сбросных Вод и распределение затрат на водоочистку между предприятиями и организациями, сбрасывающими сточные воды. В связи с этим при проектировании и разработке водоохранных комплексов огромное значение имеют расчеты процессов конвективно-диффузионного переноса и превращения веществ (КДП и ПВ).
Полностью очистить загрязненную воду, даже совершенными способами, практически невозможно и экономически нецелесообразно. Поэтому при решении проблемы охраны воды и почвы от загрязнения очень важно не допускать сброс неочищенных сточных воды в гидрологическую сеть, широко внедрять безотходные технологии и замкнутые циклы, уменьшить поливные нормы и потребление воды на единицу продукции и т. д.

АКТИВНЫЙ ИЛ

Биологические процессы очистки сточных вод различны, но все они основаны на принципах микробиологии.
Для ряда систем, требующих управления качеством воды речного бассейна, например систем промышленного, коммунального водоснабжения и водоотведения типичными входами могут быть: межбассейновый перенос воды или стоков, приток морской воды в эстуарий или из него при приливах и отливах, сезонные измене¬ния температуры, изменение содержания кислорода в воде за счет фотосинтеза или окисления органических веществ и др. Чтобы понять, удовлетворяет ли система поставленным задачам, необходимо определить выходы системы. Так, выход подсистемы -«река» может служить входом для системы питьевого или промышленного водоснабжения, которое может обеспечить обратную связь в виде входа для подсистемы «водоотведение».
В системах управления качеством воды численные значения выходов, например биохимическая потребность в кислороде (ВПК), содержание взвешенных веществ, растворенного кислорода (РК), солей, специфических ингредиентов, регламентируются соответствующими правилами.
Основные факторы самоочищения водоемов при сбросе в них сточных вод
Ухудшение качества природных вод обусловило необходимость сучения процессов переноса и превращения загрязняющих веществ в водоемах и водотоках. Под действием загрязняющих веществ и происходит сдвиг естественного равновесия многокомпонентной си
стемы, какой являются природные воды. Водный объект «мобилизует силы», противодействующие нарушению природных условий х стремящихся вернуть всю систему в первоначальное состояние. Оценка направления и интенсивности процесса самоочищения требует наличия информации о количественных характеристиках: параметрах водного объекта, свойствах, составе и режиме поступления сточных вод.
Самоочищение осуществляется под воздействием биологических процессов путем окисления растворенных и взвешенных з воде веществ растворенным в ней кислородом. Этот процесс является результатом жизнедеятельности целого комплекса водных организмов. Водная микрофлора очень разнообразна: бактерии, вирусы, бактериофаги, плесени и водоросли. Микроорганизмы играют исключительно важную роль в процессе самоочищения водоемов. Микробиологические процессы при самоочищении водо¬емов происходят в результате питания бактерий, дыхания и, наконец, их отмирания.
Начальные этапы процесса самоочищения осуществляются при участии организмов, питающихся растворенными органическими веществами. Такой способ питания характерен в первую очередь для бактерий и грибков, а также для некоторых простейших организмов. Эти организмы, используя для питания растворенные в воде органические вещества, минерализуют их. Многие водные животные, например, низшие ракообразные и коловратки, питающиеся микропланктоном, пожирают бактерии, простейших животных и мелкий органический детрит, т. е. все то, что в большом количестве присутствует в загрязненных водах. Исключительно важную роль при самоочищении водоемов играют сапрофиты — микроорганизмы, питающиеся мертвыми органическими веществами.
Органическое вещество, поступающее в водоем со сточными водами, как правило, находится в коллоидном состоянии. Для перевода коллоидов в истинный молекулярный раствор микроорганизмы выделяют ферменты.
Количество аэробных микроорганизмов, как показано рядом исследователей, зависит от концентрации растворенного в воде кислорода и содержания органических веществ: чем больше в воде растворенного кислорода и чем больше органики в водоеме, тем больше микроорганизмов. Нетоксичные вещества являются для микробов хорошей питательной средой, и процесс окисления при аэробных условиях протекает быстро. Токсичные вещества сни¬жают скорость процесса окисления.
Изменение концентрации органических взвешенных веществ (или их ВПК) определяется двумя процессами: осаждением и минерализацией. В результате попадания взвешенных веществ в водоем образуется ил. В иле, как известно, находится огромное количество микроорганизмов (в 1 г ила до 400 - 500 млн микробов). В поверхностном слое ила находятся серобактерии. Ряд бентических организмов — личинки насекомых, черви — питаются донными илами и способствуют преобразованию и минерализации нерастворенных органических веществ.
Многочисленными исследованиями доказано, что при наличии ила процесс биохимического окисления протекает в 2—В раза быстрее. При этом скорость процесса зависит от питательной среды, динамики роста численности микробов и его предела; скорость падает при достижении максимума численности. При наличии в водотоке активного ила бурно протекают процессы нитрифика¬ции, что требует большого количества кислорода. При этом на участках, где кислорода мало, могут начаться анаэробные процессы, т. е. может произойти так называемое вторичное загрязнение.
В малых реках, относительно сильно турбулизованных, т. е. с высокой концентрацией растворенного кислорода, за сутки может окисляться половина и более органических веществ. Скорость окисления возрастает с увеличением количества внутриводной растительности и планктона, что характерно для участка реки с достаточной питательной средой и микробами.
Таким образом, природные воды способны ассимилировать органические вещества способом биоокисления. Реакция биохимической потребности в кислороде (ВПК) записывается в виде: органическое вещество -> биологическое вмешательство окисленные продукты. Показатель ВПК служит характеристикой концентрации органики и определяет, какое количество кислорода требуется для полного окисления вещества (т. е. приближенно характеризует минерализацию органических веществ). Ферменты влияют на скорость реакции; скорость образования комплекса фермента и субстрата пропорциональна произведению их концентраций. Реакция может быть записана в виде: органическое вещество+бактерии и присутствии кислорода = окисленные продукты + возросшее число бактерий. При сбросе в водоем специфических соединений стационарная (фоновая) численность бактерий мала, поэтому вводится
дополнительное количество органического вещества (пищи или бактерий). Скорость биохимического окисления этого вещества сначала невелика, однако бактерии размножаются, а вместе с экспоненциальным ростом их численности идет и экспоненциальное увеличение скорости окисления постороннего органического вещества и биохимического потребления кислорода (бпк). Когда пищи для бактерий становится мало, они гибнут. При уменьшении численности бактерий падает и скорость окисления. Схематически изменение БПК во времени показано на рис. 1.11. На начальном участке низкая скорость окисления определяется малой концентрацией бактерий. В точке Л наблюдается максимум концентрации, затем она начинает уменьшаться за счет уменьшения концентрации бактерий и приближается к предельному значению БПК, равному 200 мг/л.
На основании закона действующих масс [57] и с учетом зависимости, рекомендуемой в работе [12], скорость изменения концентрации реагента (или величины БПК) может быть представ¬лена в виде:
dC/dt = —аС тС рСъ. (1.31)
Здесь и в дальнейшем С• — БПК; С" — концентрация раство¬ренного в воде кислорода; С& — концентрация бактерий; а, т, р,- п — константы; t — время добегания между контрольными ство¬рами водотока:
X
t—^dx/v(x). (1-32)
о
В ряде частных случаев в качестве первого приближения, но с достаточной для практических целей точностью может быть про¬изведена замена функции аргументом (т. е. т = п=р= 1). До на¬стоящего времени определение показателей т, п, р связано с боль¬шими трудностями и требует специальных исследований.
Таким образом, при дальнейших математических выкладках будем исходить из упрощенного уравнения
dC/dt = aCC Сб, (1.33)
принимая в одном случае С&= const; а в другом случае С" = const.
Первый случай относится к условиям сброса в водоем с низким содержанием кислорода значительного количества органического вещества и при наличии в водоеме достаточного количества бак¬терий, способных потреблять это органическое вещество. Можно предположить что концентрации веществ, принимающих участие в процессе минерализации, за исключением веществ, определяю¬щих значения БПК и концентрацию растворенного в воде кислорода, не изменяются.
Второй случай соответствует избытку кислорода (т. е. изменение концентрации кислорода будет мало сказываться на скорости процесса) или постоянства его концентрации. Начальная концентрация микроорганизмов влияет на время минерализации, и оно увеличивается при низких концентрациях. Такая модель дает удовлетворительные результаты только для того времени, когда популяция бактерий возрастает до максимума. В течение фазы от
мирания бактерий и при уменьшении концентрации субстрата возникают другие зависимости, которые требуют уточнения.
Процесс минерализации органических веществ с учетом влияния растворенного в воде кислорода
Скорость, с которой растворенный кислород потребляется в при¬родной воде или воде, загрязненной стоками, впервые была изучена Фелпсом и Стритером [11, 15]. Было найдено, что биохимическое окисление протекает примерно так же, как мономолекулярная хи-мическая реакция, т. е. скорость приблизительно пропорциональна остающейся концентрации неокисленного органического вещества и является функцией температуры. Изменение ВПК и растворенного в воде кислорода по схеме Фелпса—Стритера при коэффициентах минерализации kx) и реаэрации (k2) описывается системой уравнений:
dC'fdt = —klC'-, (1.34)
dC"/dt = dC'/dt + k2(Cnp-С") (1.35)
с начальными условиями:
t = 0; С — С0; С'=С0'. (1.36)
Здесь СПр — предельная концентрация растворенного в воде кис¬лорода.
Решение системы (1.34), (1.35) имеет вид:
С' — Со exp (—kit)-, (1-37)
k С'
С" = СПр — ■ texP (— kit) — ехр(— k2t)] —
— (Спр — С ) exp (—k2t). (1.38)
Влияние процессов осаждения и фотосинтеза на очищение сточных вод
В дополнение к рассмотренным основным факторам, определяющим процессы самоочищения, следует добавить, что неконсервативность загрязняющих веществ определяется как количеством бактерий, аэрацией и процессами окисления органического вещества, так и осаждением взвешенных частиц и фотосинтезом водных организмов.
Показатель скорости осаждения частиц в воде — гидравлическая крупность — положительный в том случае, когда плотность частиц больше плотности воды; если же плотность воды больше плотности частиц, то гидравлическая крупность окажется отрица-тельной и частицы будут иметь тенденцию к подъему и скапливанию у водной поверхности.
Осаждающиеся взвешенные вещества образуют донные отложения, которые в зависимости от толщины слоя и характера частиц могут изменяться при аэробных или анаэробных условиях. Обычно верхний слой ила (при наличии в воде растворенного кислорода) окисляется под действием аэробных бактерий, причем слой аэробного окисления тем толще и процесс тем быстрее, чем больше в воде кислорода и чем интенсивнее деятельность представителей бентоса. Если в воде кислород отсутствует, тогда весь ил, а также растворенные и взвешенные вещества изменяются при анаэробных условиях. При благоприятных условиях отложения превращаются в активный ил и вместо источника вторичного загрязнения стимулируют процессы окисления в толще воды.
Наличие в воде активного ила активизирует процесс нитрификации, а сам процесс биохимического окисления ускоряется более чем в 5 раз. Влияние на кислородный режим водоема оказывает и фотосинтез водных организмов. В малозагрязненных водоемах при благоприятных условиях развития водных организмов поступление кислорода за счет фотосинтеза больше, чем за счет аэрации потока. Однако ввиду дыхания растений потребление кислорода ночью растет, что создает напряженное состояние в водоеме. Кроме того, источник получения кислорода за счет фотосинтеза действует преимущественно в период осеннего цветения растений. Поэтому вопрос о возможности и целесообразности учета эффекта фотосинтеза при инженерных расчетах самоочищения нуждается в дополнительных лабораторных и натурных исследованиях с целью количественной оценки этого фактора.



Н.И. Друхинин, А.И. Шишкин
Математическое моделирование и прогнозирование загрязнения поверхностных вод суши


ФЕРМЕНТЫ

Ферментами (или энзимами) называют биологические катализаторы белковой природы, входящие в состав всех клеток и тканей живых организмов и ускоряющие течение отдельных химических реакций.

ПОЛУЧЕНИЕ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Источником выделения ферментов являются различные живот¬ные и растительные ткани, а также микроорганизмы. Из одних только плесневых грибов выделено около 80 различных ферментных препаратов: амилолитических, протеолитических и пекто- литических. Свыше 140 ферментов получено в настоящее время в кристаллическом и высокоочищенном состоянии.
Ввиду того что ферменты являются белками и легко подверга¬ются денатурации, все операции при их выделении и очистке следует вести в мягких условиях при температуре не выше +4°С, лучше в холодной комнате. Так как ферменты легко инактивируются при значениях pH ниже 5 и выше 9, в процессе их выделения и особенно очистки необходимо тщательно контролировать величину водородного показателя. Используемые в работе с ферментами жидкие химические реактивы должны быть перегнаны, а сухие — перекристаллизшваньк, В связи с тем, что процедура выделения индивидуальных ферментов чрезвычайно сложна, часто работу ведут с так называемыми ферментными препаратами, представляющими собой лишь частично очищенные ферменты. При получении ферментных препаратов вытяжки из тщательно гомогенизированного биологического материала, содержащего в своем составе соответствующий фермент, обезвоживают тем или иным способом. Один из наиболее распространенных приемов обезвоживания пре-паратов с одновременным освобождением их от липидов является получение ацетоновых порошков, для чего вытяжку фермента или тканевой гомогенат обрабатывают охлажденным (до —20°С) ацетоном, взятым в большом избытке. Ацетоновые порошки, пр иготовленные с соблюдением отмеченных выше условий, могут храниться в эксикаторе при 0°С без потери активности в течение длительного времени и использоваться по мере надобности. К новейшим мето¬дам обезвоживания следует отнести лиофилизацию препаратов в специальных приборах, а также использование для этой цели се- фадекса. Для получения чистых препаратов ферментов широко' используют такие эффективные методы, как электрофорез, гель- фильтрацию через сефадексы, ионообменную хроматографию и др. Одним из способов сохранения активности ферментов в течение длительного времени является получение их в иммобилизованном состоянии.    
ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТА САХАРАЗЫ (P-D-ФРУКТОФУРАНОЗИД — ФРУКТОГИДРОЛАЗА; КФ 3.2.1.26)
Оборудование, реактивы. Центрифуга; термостат; баня водяная; ступка фарфоровая; пластинка стеклянная; пробирки стеклянные химические; дрожжи пекарские; песок кварцевый; тимол; ацетон; сахароза (5%-ная); фелингова жидкость (см. приложение).
100 г пекарских дрожжей тщательно растирают в ступке с кварцевым песком. Растертую массу наносят тонким слоем на стекло и высушивают в токе сухого воздуха. Высушенные дрожжи растирают в порошок. Для извлечения сахаразы к полученному порошку приливают небольшими порциями 200 мл воды при постоянном перемешивании. Затем массу вновь растирают в фар¬форовой ступке и центрифугируют в течение 10 мин при 3000 g (или фильтруют через складчатый фильтр). Прозрачный фильтрат упаривают в вакууме при 35°С до небольшого объема и выливают в пятикратный объем охлажденного до,—20°С ацетона, переме¬шивают и через несколько минут центрифугируют при'3000 g. Образовавшийся осадок высушивают при температуре 38°С .и расти-рают в ступке в порошок. Полученный препарат сахаразы длительно сохраняется. В качестве антисептика к порошку добавляют кристаллик тимола, завернутый в фильтровальную бумагу. Для проверки активности сахаразы в две пробирки наливают по 0,5 мл 0,01%-ного водного раствора препарата.
Содержимое одной из них кипятят в течение 3 мин для разрушения фермента, после чего пробирку охлаждают. Затем в обе пробирки добавляют по 3 мл 5%-ного раствора сахарозы и ставят в водяную баню при 40°С на 10—15 мин. По истечении указанного времени в обе пробирки добавляют по 2 мл фелинговой жидкости, перемешивают и нагревают до начинающегося кипения. В контрольной пробирке (фермент разрушен кипячением) осадка оксида меди (I) не появляется. В пробирке с активным ферментом образуется красный осадок оксида меди (I), что указывает на присутствие вос-станавливающих ионы меди в степени окисления +2 глюкозы и фруктозы, образующихся при гидролизе невосстанавливающего ее дисахарида — сахарозы.


ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТА УРЕАЗЫ (КАРБАМИДАМИДОГИДРОЛАЗА; КФ 3.5.1.5)
ИЗ СОЕВОЙ МУКИ

Оборудование, реактивы. Мельница кофейная; воронка Бюхнера; ступка фарфоровая; колба коническая на 500 мл; колба для фильтрования под вакуумом; трубка резиновая с зажимом; бобы сои; петролейный (или серный) эфир; мочеви¬на (1%-ная); фенолфталеин (1%-ный спиртовой); гидроксид натрия (10%-ный); реактив Несслера (см. приложение).
100 г сухих бобов сои дважды размалывают на кофейной мель¬нице и тщательно растирают в ступке. Муку всыпают в коничес¬кую (500 мл) колбу и встряхивают в течение 10—15 мин с 200 мл петролейного (или диэтилового) эфира для обезжиривания (колбу не закрывать пробкой, беречь от огня!). Осадок отделяют на воронке Бюхнера. Экстракцию эфиром повторяют 5—6 раз. Обезжиренную муку высушивают, распределяя ее тонким слоем на стекле или фильтровальной бумаге. Высушенную, обезжиренную муку хранят в банке с притертой пробкой, предпочтительно в сухом месте. Она может долго служить для получения активных вытяжек уреазы. •. 20—30 г обезжиренной соевой муки настаивают с пятикратным количеством дистиллированной воды в течение 15—20 ч при тем¬пературе не выше 5°С. Осадок отделяют центрифугированием при 3000 g. Надосадочную жидкость упаривают в вакууме досуха при температуре 35—40°С. Полученный порошок хорошо растворим в воде. 4 :
Для проверки активности уреазы готовят 0,01%-ный раствор препарата. В пробирку наливают 5 мл 1%-ного раствора мочеви¬ны, 2—3 капли спиртового раствора фенолфталеина и 1—2 мл 0,01%-ного раствора уреазы. Пробирку помещают в термостат при 38°С на 30 мин. Параллельно ставят такой же опыт с про¬кипяченным раствором уреазы. Содержимое первой пробирки становится малиново-красным вследствие смещения реакции сре¬ды в щелочную область в результате образования аммиака. Обра¬зование аммиака можно обнаружить и иным путем. С этой целью повторяют опыт и после инкубации при 38°С в реакционную смесь осторожно добавляют равный объем 10%-ного раствора гидрокси¬да натрия. Выделение аммиака обнаруживают по запаху, по поси¬нению влажной лакмусовой бумажки у отверстия пробирки, а так¬же по образованию красно-бурого осадка при добавлении 2—3 капель реактива Несслера.





Назад к содержимому | Назад к главному меню